Resultado Proyecto

Marcadores inmunológicos y genéticos asociados a infecciones latentes o patentes causadas por Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis

Referencia: RTA2014-00009-C02-02. Organismo financiador: Ministerio de Economía y Competitividad. Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Importe: 83.000 €. Duración: 2015-2019.

Equipo investigador

Rosa Casais Goyos. SERIDA
José Miguel Prieto. SERIDA
Javier Amado Fernández. Laboratorio Sanidad Animal

Equipo técnico

Roxana González Álvarez. SERIDA

Avance de resultados

La paratuberculosis (PTB) es una enteropatía crónica con graves repercusiones económicas en las explotaciones productoras ganaderas (Figura 1). La detección temprana del agente causal, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), es esencial para reducir la transmisión de la enfermedad. Sin embargo, las técnicas actuales de diagnóstico (cultivo y PCR fecal, y ELISA) no son suficientemente sensibles para detectar animales en estadios iniciales de la enfermedad, con infecciones latentes generalmente asintomáticas y caracterizadas por la presencia de lesiones histopatológicas focales. El objetivo principal del proyecto es desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico basadas en la detección de biomarcadores bovinos asociados a las distintas formas lesionales en las que se manifiesta la PTB (lesiones focales, multifocales y difusas).

Para abordar este objetivo se trabajó en colaboración con una explotación asturiana de aproximadamente 100 vacas de raza frisona con clínica de PBT. Con el objeto de conocer la prevalencia de la PTB en la explotación, se realizó un seguimiento anual de la ganadería (2016-2018), se tomaron muestras de sangre y de heces y se analizaron mediante ELISA (IDEXX), y PCR y cultivo bacteriológico fecal específico de Map. Además, de todos los animales enviados a matadero o sacrificados en la explotación se recogieron muestras de sangre completa y de tejido intestinal.

Como podemos observar en la tabla 1 la política utilizada en la explotación de identificación de animales positivos y sacrificio de animales con clínica no ha logrado disminuir la prevalencia de la enfermedad en el periodo bajo estudio. Para mejorar esta situación se requieren nuevas técnicas capaces de detectar los animales subclínicos que no presentan signos clínicos pero están eliminando micobacterias en sus heces y transmitiendo la enfermedad a otros individuos en el rebaño.

Tabla 1. Prevalencia de la paratuberculosis en un rebaño asturiano de vacas frisonas.
Técnica de detección Muestreo 2016 (n=104) Muestreo 2017 (n=103) Muestreo 2018 (n=106)
Cultivo fecal 2,88% (N=3) 0,97% (N=1) 0,94% (N=1)
PCR fecal 6,73% (N=7) 6,70% (N=7) 8,49% (N=9)
ELISA (IDEXX) 5,77% (N=6) 6,70% (N=7) 5.66% (N=6)

Hasta el momento no se han descrito biomarcadores bovinos de PTB capaces de definir con precisión infección temprana y progresión de la enfermedad. Por ello, se procedió a la identificación mediante análisis transcriptómico por RNAseq de biomarcadores bovinos expresados en sangre y tejido intestinal (válvula ileocecal) de vacas frisonas con distintas formas histopatológicas asociadas a la PTB (n=13, lesiones focales (n=5), lesiones difusas (n=5), controles sin lesiones (n=3)), y por lo tanto en distintas etapas de la enfermedad.

El análisis transcriptómico permitió la identificación de 10 biomarcadores sobreexpresados en válvula ileocecal y sangre de animales infectados con Map con lesiones focales en su tejido intestinal en comparación con el grupo control de animales sin lesiones. Esta sobreexpresión es destacable en el caso del biomarcador 1 en válvula ileocecal y del biomarcador 8 en sangre completa. Con el objeto de validar el potencial de estas proteínas como biomarcadores de diagnóstico precoz la cantidad de los biomarcadores seleccionados en muestras de suero de animales con lesiones focales (n=17) y animales control (n=4) fue cuantificada mediante ELISAs comerciales diseñados para su detección específica.

El ELISA basado en el Biomarcador 8 obtuvo el mejor valor diagnóstico (0.875), con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 75%. Comparado con las técnicas diagnósticas actuales mostró una sensibilidad más elevada que el ELISA comercializado por IDEXX (sensibilidad 7.00%, especificidad 100%), que el cultivo bacteriológico fecal (sensibilidad 0%, especificidad 100%) y que la PCR fecal (sensibilidad 21,00%, especificidad 100%). Por otro lado, la expresión del biomarcador 8 se ha confirmado mediante inmunohistoquímica en las células de Paneth y de Globet de las Criptas de Lieberkün (Figura 2).

En conclusión, la cuantificación del Biomarcador 8 en suero podría constituir una herramienta útil de diagnóstico para mejorar la detección precoz de infecciónes de Map.

Sin embargo, el número de muestras utilizadas para su validación es muy pequeño, por lo tanto será necesario realizar una validación de estos resultados a mayor escala. Por otro lado, también sería importante demostrar que estos biomarcadores no dan lugar a reacciones cruzadas con sueros procedentes de animales infectados con otras micobacterias tales como Mycobacterium bovis.
 

Figura1.Vaca con paratuberculosis. Figura 2. Detección específica del biomarcador 8 en válvula ileocecal de una vaca con lesiones focales. Barra: 100 µm, 100X