Introducción

El cultivo celular es un proceso mediante el que células provenientes de un órgano normal o tumoral, son mantenidas in vitro en condiciones controladas para preservar al máximo su morfología y función. Las aplicaciones de los cultivos celulares son numerosas tanto en investigación básica como en investigación aplicada (Fig. 1) y permiten realizar estudios con la finalidad de conocer la morfología, el metabolismo, los mecanismos de comunicación de las células, diagnóstico de virus, la producción de proteínas para vacunas o experimentos para establecer la toxicidad de fármacos.

Tras el aislamiento, las células se cultivan y mantienen a una temperatura apropiada en una atmosfera controlada (habitualmente, 37 °C, 5% CO2 y 95% O2) en un incubador con 100% de humedad ambiente. Los medios de cultivo, fuentes de energía y compuestos necesarios para el crecimiento celular, y los diferentes sistemas existentes para el cultivo de las células, varían ampliamente para cada tipo celular. Así, hay células que crecen en suspensión en el medio de cultivo sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguíneo, mientras que la mayoría de células que forman parte de tejidos sólidos, necesitan una superficie sólida sobre la que adherirse para crecer y multiplicarse. Generalmente el soporte para los cultivos de células adherentes es la base de una placa o frasco de plástico de poliestireno. Estos cultivos siempre se han considerado en dos dimensiones (2D), es decir, monocapas de células adheridas a una superficie de crecimiento.

En un sistema de cultivo 2D, la arquitectura de los tejidos se pierde, las interacciones célula-célula se reducen y las células se adaptan anormalmente a su entorno bidimensional al aplanar su morfología y alterar la transcripción de genes, traducción de proteínas y su funcionalidad. Por ello en los últimos años se ha realizado un gran esfuerzo por desarrollar sistemas de cultivo in vitro “mejorados” que permitan reproducir mejor la situación in vivo: los cultivos celulares en tres dimensiones (3D).

Los cultivos celulares en tres dimensiones (3D)

En los cultivos 3D, las células se comportan de manera más parecida a como lo hacen en sus órganos o tejidos de origen y, como consecuencia, muestran una estructura y función significativamente mejoradas en comparación con las que presentan cuando son cultivadas de forma convencional en 2D (Fig. 2) (Knight and Przyborski 2014).

Por esta razón, la fiabilidad de la información obtenida cuando se realizan ensayos con cultivos 3D es mayor, lo que contribuye, entre otras ventajas, a reducir el número de ensayos de toxicidad y preclínicos en la industria farmacológica y a mejorar los modelos de tumores utilizados en el desarrollo de terapias citotóxicas para combatir el cáncer (Fontana F et al. 2021).

Los cultivos celulares 3D en el campo de la reproducción

En el campo de la biología de la reproducción los cultivos 3D han permitido crear numerosos modelos in vitro de órganos y tejidos del tracto reproductivo. Estos modelos, desarrollados mayoritariamente para la especie humana, se han utilizado para el estudio de enfermedades y procesos patológicos como la endometriosis, cánceres ginecológicos y trastornos de la fertilidad, dando lugar a resultados muy prometedores (Francés Herrero E et al., 2022; Zubizarreta et al 2020).

Al contrario de lo que sucede en la especie humana, en el campo de la reproducción animal hay muy pocos estudios que aborden el desarrollo y aplicación de los cultivos 3D. Estos podrían ser de gran utilidad para el estudio y desarrollo de tratamientos de patologías reproductivas que afectan frecuentemente a los animales domésticos, dando lugar a pérdidas económicas muy importantes para los productores.

El desarrollo de un cultivo 3D requiere de la puesta a punto de una serie de técnicas de cultivo celular que permitan reconstruir la anatomía y fisiología de los tejidos, además de someterlo a diversos ensayos que demuestren su adecuada funcionalidad.
 

Los cultivos celulares en la reproducción bovina

El Grupo de Reproducción Animal del SERIDA trabaja desde el año 2016 en el desarrollo de un modelo in vitro de endometrio bovino, la capa interna del útero, que permita estudiar la fisiología uterina, la comunicación materno-embrionaria durante los primeros estadios del desarrollo embrionario y diversas patologías uterinas que afectan a la eficiencia reproductiva. En los primeros trabajos realizados, se utilizó un sistema de cultivo en 2D en el que células epiteliales y células estromales aisladas del endometrio bovino crecían en compartimentos separados por una membrana porosa que permitía el paso de moléculas secretadas por las células (Fig. 3).

Este modelo permitió establecer que el endometrio bovino responde de forma diferente a la presencia de embriones dependiendo de su sexo (Gómez et al; 2017, Gómez et al 2018, Muñoz et al 2020), resultado que puede mejorar la formulación de los medios de cultivo habitualmente utilizados en la producción de embriones in vitro con semen sexado y, por ende, la eficiencia de la producción de estos embriones y su calidad.

 Los resultados publicados en 2018 por Eissa y colaboradores, describiendo las ventajas del uso de cultivos 3D para el estudio de modelos de infertilidad humana, nos guiaron para implementar el cultivo en 3D del endometrio bovino con el fin de superar algunas de las limitaciones de nuestro modelo previo en 2D.

En primer lugar, tras valorar las ventajas y desventajas de los distintos sistemas disponibles para cultivar células en 3D (gota pendiente, organoides, hidrogeles, andamios-scaffolds sintéticos) (Langhans, SA 2018), optamos por utilizar un scaffold poroso de poliestireno disponible comercialmente. Este scaffold había sido ya empleado para crear modelos celulares 3D de tejidos complejos estructuralmente similares al endometrio, y en los que distintos tipos de células se disponen de forma ordenada formando múltiples capas (Costello et al; 2021).

Así, tras poner a punto un protocolo de aislamiento celular que nos permitiera recuperar los dos tipos celulares mayoritarios en el endometrio, las células epiteliales y las células estromales (Murillo Muñoz 2021), se procedió a realizar un cultivo secuencial para crear un compartimento estromal robusto sobre el que las células epiteliales pudieran formar una monocapa similar al epitelio luminal in vivo (Fig 4).
 

A continuación, el modelo de endometrio 3D desarrollado se sometió a una caracterización morfológica exhaustiva mediante técnicas de histología clásica, inmunofluorescencia y microscopia confocal, demostrándose que la estructura del modelo 3D era similar al endometrio in vivo (Fig 4 y 5).

Por último, confirmamos la correcta funcionalidad del modelo de endometrio 3D tras evaluar las respuestas celulares, cambios en expresión génica y síntesis de prostaglandinas en respuesta a un tratamiento hormonal que reproducía las características fisiológicas del ciclo estral (oxitocina + acido araquidónico) (Díez et al 2023).

Conclusiones

Este modelo de endometrio bovino 3D permite mantener las células vivas y funcionales durante semanas, dando lugar a una herramienta innovadora que permitirá profundizar en el estudio de los mecanismos que regulan la fisiología endometrial, la evolución de infecciones uterinas del ganado bovino o el análisis de disruptores endocrinos que afectan severamente la función reproductiva en el ganado bovino.

Agradecimientos

A L. Alonso (Matadero Central de Asturias) y a M. Fernández (Asociación Española de Criadores de Ganado Vacuno Selecto de Raza Asturiana de los Valles) por facilitarnos el acceso al material biológico empleado para el aislamiento de células. Esta investigación ha sido financiada por el proyecto FICYT PCTI 2021-2023 (Grupin: IDI-2021-000102).

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