Resultado Proyecto

Identificación, caracterización genética y conservación de levaduras no-Saccharomyces aisladas en sidras asturianas. Evaluación de sus actividades enzimáticas

Referencia: RM2006-00008-00-00. Organismo financiador: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Importe: 25.680 €. Duración: 2006-2009.

Equipo investigador

Belén Suárez Valles SERIDA
Rosa María Pando Bedriñana SERIDA

Equipo técnico

Ana Lastra Queipo SERIDA

Avance de resultados

Se realizó la identificación genética de las cepas no-Saccharomyces que integran la colección de cultivos tipo del SERIDA. Las cepas, conservadas en medio glicerado a -80º C, son descongeladas (37º C) y se les realizan dos pases rejuvenecedores (inóculo 2% en GPY, 28 ºC, 18h). Como paso previo a su identificación, se llevan a cabo los controles de pureza por siembra en estría de 10µL del cultivo rejuvenecido en medio WL Nutrient Agar (28 ºC, 5 días).

La identificación genética se realizó mediante el análisis de los tamaños moleculares del amplificado de la región ribosomal 5.8S-ITS y de los fragmentos de restricción obtenidos a partir de dicho amplificado, cuando se somete a la acción de corte de enzimas de restricción. Los amplificados obtenidos mostraron cuatro tamaños moleculares: 400, 550, 625 y 750pb, siendo este último el más frecuente, representando el 76% de las levaduras analizadas.

Se identificaron las especies Metschnikowia pulcherrima (13%), Candida parapsilosis (10%), Pichia guillermondii (0.5%), Hanseniaspora valbyensis (48%), Hanseniaspora uvarum (18%) y Hanseniaspora osmophila (10%).

Como paso previo a la caracterización genética de las levaduras es necesario un proceso de extracción, purificación y concentración del ADN. El método optimizado consiste en una degradación enzimática con Zimoliasa, seguido de la lisis de la membrana y precipitación del ADN con isopropanol. La aplicación de este método sobre 5 ml de cultivo celular (GPY, agitación, 24h) condujo a la extracción del material nucleico de forma reproducible y en concentraciones superiores a 10 ng/µL. El ADN de todas las levaduras se mantiene congelado (-20º C).

En la actualidad, se aborda la caracterización genética por el método RAPD–PCR (Random Amplified Polymorphism Detection) utilizando como cebador el OPA-03. Se ha comenzado el estudio de la variabilidad genética de cepas de las especies Hanseniaspora valbyensis y osmophila. Los resultados preliminares muestran un gran número de bandas diferentes cuyos tamaños oscilan entre 300-1340 pb. Paralelamente, se evaluarán  las actividades enzimáticas de las distintas estirpes mediante medios sólidos en placa.