Resultado Proyecto

Diagnóstico y caracterización de Pseudomonas fitopatógenas en cultivos de interés agroalimentario en el Principado de Asturias

Referencia: RTA2005-0076-00-00. Organismo financiador: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Importe: 59.400 €. Duración: 2005-2008.

Equipo investigador

Ana J. González Fernández SERIDA
Dolores Loureiro Rodríguez SERIDA
Germán González Varela INIA (Becario)
Mª Rosario Rodicio Rodicio Universidad de Oviedo
Mª Carmen Mendoza Fernández Universidad de Oviedo (Asesora)

Entidades Colaboradoras

Caja Rural de Asturias
Universidad de Oviedo

Avance de resultados

En el cultivo de la judía tipo granja asturiana se ha podido aislar e identificar Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, agente causal de la grasa de la judía, en tres especies de malas hierbas pertenecientes a dos géneros diferentes: Solanum y Polygonum. Hasta el momento, no se había citado esta bacteria más que en especies de leguminosas. Este hecho tiene una gran trascendencia epidemiológica para el control de la enfermedad. Se han obtenido aislamientos de otras especies bacterianas a partir de malas hierbas, que siguen en estudio para aclarar su papel en el patosistema de la judía asturiana.

En 114 aislamientos de P. s. pv phaseolicola, pertenecientes a la colección del SERIDA, se realizó un análisis de macrorrestricción genómica mediante electroforesis en campo pulsante (PFGE), lo que permitió separar las cepas en dos grupos, uno que incluye las de procedencia asturiana y castellano-leonesa, que no utilizan manitol como única fuente de carbono y son tox + y otro que sólo incluye cepas de Castilla y León, que tienen la capacidad de utilizar manitol como fuente de carbono y no presentan el “cluster” tox (responsable de la producción de faseolotoxina). La aplicación de esta técnica permitió diferenciar 29 perfiles (P1-P29) de los que 11 fueron exclusivos del Principado de Asturias, 14 de Castilla y León y dos aparecieron en ambas regiones. Como controles se utilizaron las cepas de la Colección Española de Cultivos Tipo, CECT 321 y 4390, que generaron perfiles diferentes. Además, se utilizó la técnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) con 123 cepas de P. s. pv phaseolicola y 10 iniciadores diferentes, obteniéndose, en la mayor parte de los casos, un único RAPD tipo para todas las cepas aunque, en algún caso, se pudieron diferenciar dos tipos que se corresponden con las cepas tox + y tox -.

En el cultivo del kiwi se caracterizaron fenotípica y genotípicamente las cepas recogidas por el SERIDA y Sanidad Vegetal desde el año 2000, que habían sido asociadas con la caída del botón floral. Esto nos permitió identificar un lote de cepas que corresponden a P. viridiflava, con las que se continúa haciendo estudios sobre factores de virulencia y otro que corresponde a P. syringae y otras pseudomonas fluorescentes, muy heterogéneo, lo que dificulta su estudio. Esta heterogeneidad se corroboró aplicando RAPD al estudio de las cepas. Se realizaron, también, estudios complementarios de patogenicidad sobre planta inoculada en condiciones de campo, tanto con P. syringae como con P. viridiflava, encontrando bacterias capaces de hacer caer todos los botones, inoculados tanto con una especie como con otra.

En el caso de bacterias de difícil identificación se utilizó, como primera opción, la amplificación y secuenciación del ADNr 16S. Sin embargo, esta técnica no llegó a permitir la identificación de bacterias muy próximas, como es el caso de los patovares de P. syringae. Para estos casos, se comenzó a aplicar la técnica MLSA (Multilocus Sequence Analysis) a tres cepas (LFPA 221-223) obtenidas de un cultivo de soja forrajera con síntomas de bacteriosis. Estas cepas son próximas a P. viridiflava y con ellas se amplificaron cinco genes diferentes que fueron reducidos a tres, debido a la aparición de amplificaciones inespecíficas. Con estos tres genes, rpoD, gyrB y gltA, y el ADNr 16S, se obtuvieron resultados no coincidentes entre ellos, en concordancia con lo encontrado por otros autores, de forma que se sigue trabajando para mejorar los resultados obtenidos en cuanto a su congruencia filogenética. A estas cepas se les realizó su perfil bioquímico y se sometieron a análisis de macrorrestricción genómica con SwaI, seguida de PFGE, de forma que se vio que las tres, pese a ser biotipos distintos por su fenotipo, correspondían a un mismo tipo genético. Su caracterización patogénica nos llevó a comprobar que causan daños en soja pero no en faba granja asturiana.

En cuanto al estudio in vitro de productos fitosanitarios y metales, conviene resaltar que se analizaron un total de 127 aislamientos de Pseudomonas fitopatógenas, procedentes de distintos hospedadores y procedencias, que correspondían con las especies P. syringae y P. viridiflava,  utilizándose como controles las cepas 4429 (P. syringae pv. syringae), 458 (P. viridiflava) y 108 (P. aeruginosa) de la Colección Española de Cultivos Tipo. Para estudiar la concentración mínima inhibitoria, se utilizó el medio MGY (Manitol Glutamato suplementado con 0,25 g/l de extracto de levadura) frente a seis metales pesados: cobre (CuSO₄.5H₂O), cobalto (CoCl₂.6H₂O), mercurio (C₂₀H₈Br₂HgO₆Na₂), litio (LiCl), zinc (ZnCl₂ y ZnSO₄.7H₂O) y hierro (FeCl₃.6H₂O y (SO₄)₂Fe(NH₄)₂.6H₂O); y tres productos fitosanitarios: Kasuminâ (8% p/p Kasugamicina), Kasumin Cobre (5% Kasugamicina y 45% Oxicloruro de cobre) y Betasol 500 (CuSO₄). Por lo general, los aislamientos fueron sensibles a los compuestos ensayados, exceptuando la alta tolerancia que presentaron frente al compuesto de litio.

Los fitosanitarios más utilizados actualmente en España como antibacterianos son compuestos de cobre, kasugamicina y la mezcla de ambos. No se detectaron resistencias frente a los fitosanitarios, pero la respuesta al sulfato de cobre fue diferente en las distintas bacterias analizadas. Así en P. syringae pv. phaseolicola no se detectó resistencia, mientras que si se detectó en un caso de P. viridiflava y en dos de P. syringae pv. no determinado (npv.). En general, P. viridiflava, P. syringae pv. syringae y P. syringae npv, presentaron mayores niveles de resistencia que  P. syringae pv. phaseolicola, acercándose en algunos casos al punto de corte establecido para la misma (250 mg/ml para CuSO₄).

Conclusiones

• Pseudomonas viridiflava con características atípicas es una bacteria frecuente en los cultivos asturianos y causa daños importantes sobre todo en el cultivo del kiwi en donde, dependiendo de factores climatológicos, puede llegar a producir pérdidas considerables. La descripción de este nuevo tipo bacteriano abre muchos interrogantes que continúan en estudio.
• Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, agente causal de la grasa de la judía, se encontró en malas hierbas asociadas al cultivo, aspecto en el que se profundizará en el proyecto que actualmente se ha puesto en marcha.
• La técnica de macrorrestricción genómica, seguida de electroforesis en campo pulsante, mostró ser muy útil para caracterizar cepas bacterianas y, por tanto, para los estudios epidemiológicos que se van a realizar. También, se seguirá utilizando la técnica RAPD por su facilidad de realización, aunque los resultados obtenidos fueron diferentes según el organismo estudiado.
• Se encontró un nuevo tipo bacteriano, próximo a P. viridiflava, que se mostró como patógeno en soja pero no en judía tipo granja asturiana.
• No parece que estén extendidas las resistencias a fitosanitarios y metales entre los aislamientos de Pseudomonas asturianos, aunque se encontró alguna cepa con resistencia a cobre.