Resultado Proyecto

Desarrollo de un método serológico para el diagnóstico "multiespecie" de la sarna sarcóptica mediante el uso de antígenos recombinantes y anticuerpos monoclonales específicos de Sarcoptes scabiei

Referencia: RTA2009-00114-00-00. Organismo financiador: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Importe: 60.000 €. Duración: 2009-2011.

Equipo investigador

Rosa Casais Goyos SERIDA
José Miguel Prieto Martín SERIDA
Antonio José Sanz Fernández INGENASA
Carmen Vela Olmo INGENASA

Equipo técnico

Paloma Solano Sobrado SERIDA
Ana Camuñas Talavera INGENASA

Avance de resultados

Objetivo 1. Adaptación del ELISA indirecto, basado en el antígeno recombinante Ssλ20∆B3, al diagnóstico de la enfermedad.

En primer lugar, se estudió la resistencia y estabilidad del antígeno Ssλ20∆B3, comprobándose que la pérdida de actividad observada en placas antigenadas y sometidas a una prueba de estrés (incubación a 45 °C durante seis semanas) fue menor al 50%, lo cual indica que el antígeno es un buen candidato para su uso en un ELISA comercial.

Posteriormente, se establecieron las condiciones óptimas del ensayo (dilución de suero, tipo y dilución del conjugado y tipo de sustrato). En las condiciones preseleccionadas, utilizando un panel de 41 sueros de cerdo procedentes de granjas libres de sarna, se calculó el punto de corte del ELISA para la especie, el cual corresponde a un % de DO_450nm relativa del 12%. Para este punto de corte el ELISA adaptado tiene una especificidad diagnóstica del 97,6% y una sensibilidad del 45% (ver tabla 1).
 

Tabla 1. Parámetros de validación del ELISA adaptado

Finalmente, se valoró, en colaboración con la Universidad de Murcia, el potencial del ELISA para el diagnóstico en condiciones de campo. Para ello, se analizaron los sueros de 90 madres reproductoras, en las que se determinó la presencia de S. scabiei en el pabellón auricular y lesiones papulomatosas en la canal compatibles con sarna (Figura 1). En matadero se observaron lesiones compatibles con sarna en un 80% de los animales, pero en ninguno de ellos se pudo confirmar la enfermedad mediante el aislamiento de ácaros de Sarcoptes. Sin embargo, con el ELISA adaptado, fue posible detectar una prevalencia de la enfermedad del 37,8%, pudiendo alcanzar el 55,6% si contabilizamos los animales dudosos. No obstante, este dato no refleja la proporción de madres con lesiones. Este resultado podría indicar que el origen de las lesiones observadas no es siempre el ácaro S. scabiei o bien que la baja sensibilidad del ensayo no nos permite detectar todos los animales positivos.

Figura 1. Cerdos con lesiones papulomatosas compatibles con sarna sarcóptica.

Objetivo 2. Desarrollo de un ELISA de competición, basado en el uso de anticuerpos monoclonales (AcMs) específicos de S. scabiei, para el diagnóstico “multiespecie” de la enfermedad.

Se obtuvieron dos AcMs marcados con peroxidasa: 31F2 y 1H4F4. Con estos dos AcMs se intentó desarrollar un ELISA de competición. Para determinar el porcentaje de competición obtenido con los distintos AcMs, se prepararon tres mezclas de sueros: un mezcla positiva, una dudosa y otra negativa, asumiéndose un 0% de competición por parte de la mezcla negativa (100% de unión del AcM a la placa). Con el AcM 1H4F4 no se obtuvo competición alguna, posiblemente debido a que su enorme afinidad por el antígeno es capaz de desplazar incluso la unión de los anticuerpos específicos presentes en el suero de los animales positivos. Con el AcM 31F2 se obtuvo una competición sólo parcial (71%) de la mezcla positiva (ver tabla 2). Estos resultados pueden interpretarse como que el AcM posee una alta afinidad por el antígeno y, por tanto, el suero problema tiene dificultad para desplazar su unión, o bien la mezcla positiva posee pocos anticuerpos que reaccionen con el epítopo reconocido por el AcM.

Tabla 2. Porcentaje de competición
 

Por lo tanto cabe concluir que es necesario mejorar el ELISA para alcanzar los niveles de sensibilidad que precisa una técnica comercial.