Resultado Proyecto

Mantenimiento del Banco de Recursos Zoogenéticos de Razas Domésticas Autóctonas en Peligro de Desaparición del Principado de Asturias

Referencia: RZP2013-00006-00-00. Organismo financiador: Ministerio de Economía y Competitividad. Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Importe: 60.000 €. Duración: 2014-2017.

Equipo investigador

Carlos Olegario Hidalgo. SERIDA
Carolina Tamargo Miguel.SERIDA (2014-2015)
Carmen Fueyo Díaz. SERIDA
José Néstor Caamaño Gualdoni. SERIDA (2016)

Equipo técnico

Ángel Fernández García. SERIDA
Mª José Merino Hernantes. ASEVA

Avance de resultados

Las actividades desarrolladas durante el año 2014 para la ampliación del Banco de Recursos Zoogenéticos de Razas Domésticas Autóctonas del Principado de Asturias incluyeron el trabajo con donantes de raza bovina Asturiana de la Montaña, de raza caprina Bermeya, de raza porcina Gochu Astur-Celta y de raza ovina Xalda.

1. Obtención y criopreservación de semen bovino

Los machos de raza Asturiana de la Montaña utilizados para la recogida seminal fueron cedidos por la Asociación Española de Criadores de ganado vacuno selecto de la raza Asturiana de la Montaña (ASEAMO). Los animales utilizados para la recogida seminal se alojaron en el Centro de Recogida de Semen de Cenero.
Se dispuso de 2 sementales.

Para la criopreservación de dosis seminales de toro Asturiano de la Montaña, en el eyaculado obtenido mediante vagina artificial se determinó volumen, concentración y motilidad. Si dichos parámetros superaban los mínimos necesarios para su procesamiento, se le añadía un diluyente comercial de congelación. El semen diluido se enfrió de manera progresiva (0,2º C/min) hasta 5º C, permaneciendo un mínimo de 3 horas a esa temperatura. El envasado se realizó en dosis de 0,25 ml, que, posteriormente, se congelaron en un biocongelador programable en vapores de nitrógeno. Tras la congelación, las dosis se sumergieron en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

De cada uno de los eyaculados procesados, se tomó una muestra representativa (3 pajuelas) y se realizó una contrastación post-descongelación, en la que se evaluaron los efectos de los crioprotectores y del proceso de congelación, además de permitir la calificación de los individuos en función de su calidad seminal.

 
2. Obtención y criopreservación de embriones bovinos

Las 3 hembras donantes de raza Asturiana de la Montaña, pertenecientes a ASEAMO y seleccionadas por criterios genéticos, fueron alojadas en las instalaciones del Centro de Biotecnología Animal de Deva. 

Rutina de trabajo

La superovulación se realizó con un preparado comercial de gonadotropinas de extractos de pituitaria porcina, FSH-P (320-400 mg of Folltropin®, Bioniche Pharma, Canadá) administrada vía intramuscular durante 4 días, en dos dosis diarias, con 12 horas de intervalo, y en concentraciones decrecientes. El tratamiento de superovulación comenzó entre el día 9 y el 10 del ciclo. Las vacas recibieron una inyección de un análogo sintético de PGF2α (2ml i.m. EstrumateÒ, Schering-Plough, Alemania) 72 horas después de iniciado el tratamiento, para inducir la luteolisis. Las donantes se inseminaron a las 48, 56 y 72 horas tras la administración de PGF2α con dos dosis de semen descongelado en cada ocasión.

El día de la colecta se valoró la respuesta superovulatoria (número de cuerpos lúteos) mediante palpación rectal, procediéndose al lavado de la donante cuando se había detectado al menos un cuerpo lúteo. La recogida de los embriones se realizó entre los días 6 y 7 tras el estro mediante un lavado transcervical no quirúrgico (flushing) de los cuernos uterinos, utilizando una sonda de tres vías que permite la entrada del medio por una vía hasta el útero, y la salida del medio (PBS + 0.2% BSA) con los embriones por otro. El medio recogido se filtró (filtro EMCON) y se examinó bajo microscopio estereoscópico para buscar los embriones.

Se valoraron y clasificaron los embriones obtenidos de acuerdo a los criterios de la International Embryo Transfer Society (IETS) en función del grado de desarrollo y de la calidad del embrión, congelándose únicamente los de calidades 1 (excelentes) y 2 (buenos). El crioprotector utilizado fue etilenglicol 1.5M y, tras envasarlos en pajuelas de plástico de 0.25 cc (IMV, Francia), se congelaron en un biocongelador (Bio-Cool II, FTS Systems Inc.) utilizando la siguiente curva de enfriamiento: enfriamiento directo a -7°C durante 5 min, inducción de la cristalización, espera de 5 min y descenso a -35ºC a una velocidad de 0.3°C/min; llegadas a esta temperatura, las pajuelas conteniendo los embriones se almacenaron en nitrógeno líquido (-196°C).

3. Obtención y criopreservación de semen caprino

Los 7 machos donantes de raza Bermeya con los que se trabajó fueron adiestrados, en el último trimestre de 2013, para la recogida de semen en vagina artificial, en presencia de una cabra en celo.
De cada eyaculado recogido se valoró el volumen, su concentración (mediante el uso de un espectrofotómetro) y su motilidad, por métodos subjetivos y objetivos (sistema CASA), además, del resto de pruebas de calidad seminal objeto de estudio (morfología, integridad del acrosoma y endósmosis. Aquellos eyaculados que superan los requisitos mínimos de calidad establecidos, son procesados para su congelación. En el caso del semen caprino, hay que añadir a los eyaculados una solución de lavado elaborada en el laboratorio, para proceder a su centrifugación y eliminación del plasma seminal. Tras lo anterior, se resuspenden los pellets con el diluyente no glicerolado, compuesto por un tampón (TRIS), un azúcar (glucosa), yema de huevo, ácido cítrico y antibiótico y, seguidamente, se completa el proceso de dilución aportando el segundo diluyente de congelación, que a lo anterior, añade un 8% de glicerol. Se procede al descenso progresivo de la temperatura en un baño termostático programable, hasta 5 ºC a lo largo de 3 horas, estabilizándolo a esa temperatura durante una hora más. Después se procede a su envasado en dosis seminales previamente identificadas con toda la información legalmente establecida, que contienen 100 millones de espermatozoides por dosis, congelándolas en un biocongelador programable y depositándolas en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

4. Obtención y criopreservación de semen porcino

Los 5 machos de raza Gochu Astur-Celta utilizados para la recogida seminal fueron alojados en las instalaciones del Centro de Biotecnología Animal de Deva. Dos de ellos, desde el 2 de octubre de 2013, y que pertenecían al núcleo poblacional que el SERIDA tiene en Villaviciosa y los tres restantes, a partir del 27 de febrero, seleccionados por ACGA de sus ganaderos asociados.
Se procedió a un período de entrenamiento en el cual los cerdos, que se alojaron en parques individuales, eran conducidos tres días por semana hasta el maniquí de recogida para familiarizarse con todo el proceso.
Tras este período comenzó la recogida de semen, de uno o dos días por semana, hasta el 19 de noviembre. Para la colecta se utilizó la técnica de mano enguantada o método manual. La calidad de los eyaculados de tres de los animales fue excelente por lo que a partir del día 31 de enero, y con los requisitos fijados en el documento nº2 de la última reunión de la comisión de seguimiento (30/10/2013), comunicamos a ACGA la posibilidad de disponer de dosis de semen porcino refrigerado de los tres donantes.

 Rutina de trabajo:

Tras la recogida de la fracción espermática de los eyaculados porcinos, se determinaron microscópicamente las características de calidad de los mismos mediante las técnicas laboratoriales habituales. Posteriormente, el semen se enfrió lentamente hasta 17ºC, procediéndose entonces a su centrifugación y eliminación de la fase sobrenadante. Los pellets se resuspendieron con un diluyente a base de yema de huevo y lactosa, enfriándose progresivamente hasta 5ºC, momento en que se añadió el crioprotector y se envasó en dosis de 0,5 ml., para su congelación en vapores de nitrógeno en un biocongelador programable.

A petición de la Asociación de Criadores de Gochu Astur-Celta (ACGA), se les suministraron un total de 10 dosis seminales refrigeradas del semental ACGA-3889, con destino a 6 criadores. Hasta el momento, la Asociación sólo ha comunicado un parto con el nacimiento de 8 lechones.

5. Obtención y criopreservación de semen ovino

Los 7 machos donantes de raza Xalda, seleccionados por ACOXA, fueron alojados desde el 29 de octubre de 2014 en las instalaciones del Centro de Biotecnología Animal de Deva. El retraso en la llegada de los mismos, prevista en principio para el 1 de septiembre, se debió a dificultades de última hora en la selección de los mismos por parte de la Asociación de criadores.

Desde esa fecha, se adiestraron para la recogida de semen con vagina artificial, uno o dos días por semana, en una sala provista de un foso, donde se sitúa el operario, y en presencia de una oveja en celo.