Resultado Proyecto

Nueva variante del RHDV (RHDV-N11): Estudio de la patogenia y la respuesta inmune en conejos infectados experimentalmente o vacunados

Referencia: E_RTA2013-00044-00-00. Organismo financiador: Ministerio de Economía y Competitividad. Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Importe: 59.330 €. Duración: 2014-2017.

Equipo investigador

Rosa Casais Goyos. SERIDA
José Miguel Prieto Martín. SERIDA
José Manuel Martín Alonso. Universidad de Oviedo
Francisco Parra Fernández. Universidad de Oviedo

Avance de resultados

En noviembre de 2011 se detectó por primera vez en España una nueva variante del virus de la enfermedad hemorrágica de los conejos (RHDV-N11), genética y antigénicamente distinta al RHDV clásico. A diferencia del RHDV clásico, la nueva variante causa mortalidad en conejos jóvenes de 11 a 35 días, y en adultos vacunados. Por ello, el objetivo principal de este estudio ha sido investigar las diferencias existentes entre el virus clásico y la nueva variante en cuanto a patogenicidad, vías de propagación, y respuesta inmune en conejos jóvenes (<35 días) y adultos infectados experimentalmente con RHDV-N11. Asimismo, se ha estudiado la transferencia de inmunoglobulinas protectoras de madres vacunadas frente a RHDV-N11 a gazapos.

1. Patogenia. Tras la infección no se observaron signos clínicos nerviosos, respiratorios o digestivos en ningún animal. Se detectó fiebre el día 1 post-infección (PI) en el 28,5% y el 30% de los conejos adultos y gazapos, respectivamente. La tasa de mortalidad observada en conejos infectados experimentalmente con RHDV-N11 difiere entre los dos grupos de edad estudiados, siendo del 15 % en gazapos y del 0% en conejos adultos. En el grupo de gazapos la fiebre y la viremia están significativamente (p<0,001) asociados con la muerte. Sin embargo, ninguno de los conejos adultos sucumbió a la enfermedad.

Por otro lado, se investigaron las diferencias entre gazapos y adultos infectados en cuanto a tropismo tisular de RHDV-N11 mediante la detección del RNA (RT-PCR específica) y el antígeno viral (inmunohistoquímica) en distintos tejidos (hígado, bazo, intestino, riñón, pulmón y corazón). El análisis estadístico de los resultados reveló que las variables edad, tejido y tiempo (días PI) tienen un efecto significativo (p<0.0001, en todos los casos) sobre el número de copias de RNA viral detectado en cada tejido. El hígado y el bazo contenían los niveles más elevados de RNA y proteína viral. El número total de copias de RNA viral fue más elevado en gazapos los días 1 y 2 PI (p<0,0001). Las lesiones histológicas provocadas por el virus fueron más frecuentes y severas en el hígado y el bazo; en gazapos también se observaron lesiones en el intestino. Aunque los adultos no presentaban lesiones o antígeno viral en el intestino ambos grupos de edad mantuvieron niveles constantes de RNA viral en este tejido entre los días 1 y 7 PI.

2. Respuesta inmune humoral. La cinética de la respuesta inmune humoral (IgGs) fue similar en conejos adultos y gazapos, no se detectaron anticuerpos específicos los días 1 y 2 PI mientras se observó un aumento significativo (p<0,0001) de dichos niveles el día 7 PI, que a su vez fueron significativamente más altos en adultos (p<0,0001). Los conejos no tuvieron tiempo para desarrollar una respuesta inmune humoral efectiva frente a la infección ya que el curso de la enfermedad fue muy rápido, la mortalidad observada tuvo lugar a las 48 horas PI.

3. Vías de propagación. Se investigó la presencia del RNA viral en secreciones nasales (hisopos nasales) y en heces (hisopos rectales) a distintos tiempos PI (1, 2 y 7 días PI) mediante RT-PCR específica. Se comprobó que el día PI (p<0,0001) y el origen del hisopo (p<0,0001) son factores que determinan la eliminación de virus por las distintas vías. En conejos adultos la eliminación de virus a través de secreciones nasales es prácticamente inexistente, siendo la principal vía de diseminación en este grupo la fecal y observándose un pico de eliminación de virus el día 2 PI. En gazapos se detectó la presencia de RNA viral en secreciones nasales y en heces, aunque la cantidad de virus eliminada por vía fecal fue más elevada. El RNA viral fue detectado en el intestino de todos los conejos cada día.

4. Transferencia de inmunoglobulinas protectoras de madres vacunadas a gazapos. Se analizó la transferencia de inmunidad protectora frente a la nueva variante de madres reproductoras vacunadas (Cunipravac RHD Variant) a gazapos. Las madres vacunadas desarrollaron niveles positivos de anticuerpos específicos en suero frente a RHDV a partir del día 20 post-vacunación. Asimismo, la leche materna contenía niveles positivos de anticuerpos anti-RHDV los días 1 y 17 post-parto. Tras desafiar con RHDV-N11 gazapos de 30 y 48 días de edad procedentes de madres control y de madres vacunadas se observó un 100% de protección en los gazapos descendientes de madres vacunadas. Sin embargo, en los gazapos control de 30 y 48 días se observó una mortalidad del 75% y 84%, respectivamente.

CONCLUSIONES:

1. La identificación de las fuentes potenciales de infección es esencial para la gestión de las granjas cunículas. Así, hemos demostrado que la principal ruta de diseminación de RHDV-N11 en conejos adultos y gazapos es la fecal, una fuente alternativa de virus con respecto al RHDV clásico. Por ello, el manejo de las heces constituye un punto crítico para el control de la enfermedad. Por otro lado, hemos visto que la baja tasa de mortalidad producida por la nueva variante en ocasiones da lugar a la existencia de conejos que sobreviven a la infección y se convierten en individuos aparentemente sanos pero eliminadores de virus. La implantación de medidas de control efectivas debe incluir la identificación de estos individuos para asegurarnos de que no permanezcan en las granjas o sean importados.

2. El diseño de estrategias y pautas de vacunación adecuadas para cada rango de edad es esencial para el control de la enfermedad. En este sentido hemos comprobado que los gazapos descendientes de madres vacunadas frente a la nueva variante están protegidos frente al virus al menos hasta los 48 días de edad. En el futuro se investigarán los mecanismos responsables de esta protección.